How to use tiny indel markers

The following are the results of research conducted in collaboration with Dr. Takahiro Noda (Kumamoto Prefectural Agricultural Research Center) and his colleagues . We published the results as an open access paper as follows.

Noda, T., Daiou, K., Mihara, T., & Nagano, Y. (2020). Development of Indel markers for the selection of Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.) hybrids that can be used for low-cost genotyping with agarose gels. Euphytica, 216:115.

We have developed this research method to select the Satsuma mandarin x Satsuma mandarin. However, we show this method here because it has the potential to be used in animals, plants and microorganisms.

Requirements: Organisms with a high number of tiny indel markers (20-30 bp) are eligible for this method.

  1. Go to the NCBI website and look for the reference genome sequence of the species under study. Download the reference sequence.
  2. Read the DNA sequence of the individual(s)/species under study (e.g. the parents for the crossing) with a short read sequencer. Map the short reads to the reference genome sequence using bwa etc. Create a vcf file using DeepVariant etc. Find about 20-30 bp of tiny indel markers in the vcf file. (We have had success with 17 bp in our case.) The next figure shows an IGV visualization of one of the tiny indel markers. Next, design PCR primers to flank this tiny indel marker. The PCR product should be less than 300 bp in size.

  1. Perform PCR using the designed primers and analyze the PCR products by 4% agarose gel electrophoresis. As shown in the next figure, heterozygous and homozygous loci can be distinguished easily.

For 1 and 2 above, we may support researchers in developing countries. (Contact information: Dr. Yukio Nagano, Saga University, nagano@cc.saga-u.ac.jp)

Primer sequences for Citrus species ara available here.

Tiny indel markersの活用法

熊本県農業研究センターの野田孝博博士らと共同で行った研究の成果を紹介します。この成果は、以下にオープンアクセスの論文として、発表しています。

Noda, T., Daiou, K., Mihara, T., & Nagano, Y. (2020). Development of Indel markers for the selection of Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.) hybrids that can be used for low-cost genotyping with agarose gels. Euphytica, 216:115.

ウンシュウミカン×ウンシュウミカンを選抜するために、この研究方法を開発しました。しかし、動物・植物・微生物に幅広く活用できる可能性があるため、ここに紹介します。

必要条件：20-30 bpくらいのtiny indel markersの多い生物がこの方法の適用対象となります。

  1. 研究対象の種の参照ゲノム配列をネットから探してダウンロードします。または、参照ゲノム配列をロングリードシーケンサー等を活用して、作成します。アノテーションをしなければ、多細胞真核生物でも、参照ゲノム配列の作成は容易です。
  2. 研究対象の生物（例：掛け合わせに使った親）のDNA配列をショートリードシーケンサーで読みます。bwa等を用いてショートリードを参照ゲノム配列にマッピングします。次に、DeepVariant等を用いて、vcfファイルを作成します。vcfファイルから20-30 bpくらいのtiny indel markersを探します。当方では17 bpでも成功しています。下図は、そのtiny indel markerの一つをIGVで可視化したものです。次にこのtiny indel markerを挟むようにPCR用のプライマーを設計します。PCR産物のサイズは300 bp以下になるように設計します。

  1. 設計したプライマーを用いてPCRを行い、4%アガロースゲル電気泳動で分析します。図のように、ヘテロ接合及びホモ接合を区別することが出来ます。

3は出来そうだけど、1と2が難しいと感じる方が多いかもしれません。1と2については、共同研究が実施可能な場合がありますので、佐賀大学・永野幸生 nagano@cc.saga-u.ac.jp までご連絡ください。

カンキツ用のプライマー配列はこちらで確認できます。